其實雙鏈DNA的熔解分析可追溯到上世紀六十年代，當時是通過紫外吸收來監測的。分析需要幾微克的DNA，而樣品以0.1-1.0°C/分鐘的速率緩慢加熱，常常要花上幾個小時才能完成。后來，LightCycler定量PCR儀的出現，讓熒光熔解分析變得流行。樣品量因毛細管而縮減至納克級，且熔解速率更快，達0.1-1.0°C/秒，這樣熔解時間縮短至幾分鐘。當時使用的染料是SYBR®GreenI。
然而，這種熔解分析只能區分在片段大小和GC含量上差別較顯著的DNA序列，比如檢查PCR擴增產物中是否存在引物二聚體及其他非特異性的擴增。如果要區分SNP，分辨率還不夠。為什么呢?這里有必要先介紹一下飽和染料和非飽和染料。SYBRGreenI就屬于非飽和性染料，由于它對PCR的抑制作用，在實驗中的使用濃度很低，遠未將DNA雙螺旋結構中的小溝飽和。這樣，DNA雙鏈高溫變性時，單鏈部分的熒光染料分子發生重排，熒光染料分子重新結合到雙鏈DNA的空置位點，造成熒光信號沒有變化，因此出現假陰性，特異性下降。
于是，飽和染料問世了。為什么稱為飽和染料呢?因為它們即便在飽和濃度(熒光最大)下，也不會抑制PCR。故高濃度的染料飽和了DNA雙螺旋結構中的小溝，在DNA解鏈過程中就不會發生重排，這樣熔解曲線才有了更高的分辨率。目前市場上的飽和染料主要有LCGreen、LCGreenPlus、SYTO9等幾種。光有染料還不夠，儀器也要相應升級呢。
擴增子的熔解曲線完全取決于DNA堿基序列。序列中如有一個堿基發生了突變，都會改變DNA鏈的解鏈溫度。但是這個差異極小，只有零點幾攝氏度，如果儀器的分辨率不高，是根本無法檢測的。
那么什么樣的分辨率才是高分辨率呢?根據儀器現有的功能測試，在熔解操作時每攝氏度至少要獲得10個數據點，這是對儀器的最低要求。此外，溫度均一性也同樣重要。如果兩孔之間溫度相差0.1°C，就很可能導致最終的熔解溫度相差0.1°C，這樣就無法保證HRM分析結果的準確性。大多數常規定量PCR儀的孔間溫度差在0.3-0.5°C，這也決定了它們無法勝任HRM。
目前市場上有多個廠家提供HRM分析的儀器，包括IdahoTechnology、Corbett(QIAGEN)、Roche等，有些是專供HRM的儀器，有些則是附帶HRM功能的定量PCR儀。HRM的發明者—美國猶他大學醫學院的Wittwer實驗室曾評估了市場上多臺儀器在基因分型和突變掃描上的性能1。他們發現，對于大部分儀器的準確基因分型來說，主要限制在于平板上的空間溫度差異(Tm的標準偏差為0.020-0.264°C)。其它差異如數據密度、信噪比和熔解速率，也會影響雜合體的掃描。經過比較發現，空氣加熱型儀器以及樣品溫度單獨控制的儀器有著更低的Tm標準偏差(0.018-0.065)，而加熱塊型儀器則在0.092-0.274。
在擁有飽和染料和高分辨率儀器之后，HRM分析就可以開始啦。這個過程其實很簡單，就是對PCR的擴增子進行加熱，溫度從50°C逐漸上升到95°C。在此過程中，擴增子逐漸解鏈，在到達熔解溫度(Tm)時，DNA鏈完全分開。在HRM分析的初期，熒光強度很高，隨著溫度升高，雙鏈DNA逐漸減少，熒光強度也就下降了。HRM儀器通過照相機，記錄下熒光變化的整個過程。通過對數據的作圖，就生成了熔解曲線。索取更詳細的技術資料渦街流量計
果然夠簡單吧，連探針也無需設計，只要在常規PCR中加一個飽和染料即可。HRM既可以對未知突變進行篩查、掃描，也可以對已知突變進行分析。相對于傳統的突變分析而言，操作步驟大大簡化，時間和成本也降低了不少。而且樣品經PCR擴增后直接進行HRM分析，無需轉移，真正實現了閉管操作，降低了污染的風險。
正是憑借這些優勢，HRM近年來廣泛用于突變掃描、序列配對、基因分型和甲基化分析等應用中。
序列配對
序列差異分析常用的方法包括單鏈構象多態性、變性梯度凝膠電泳、變性高效液相色譜、測序等，這些方法都需要分離樣品，之后進行多步反應，操作繁瑣，耗時長，且PCR產物有污染的風險。而HMR在5分鐘之內就能完成，無需額外的步驟，也容易開發成高通量篩選，且是唯一的閉管操作，增加了分析的可靠性，這些優勢對于分子診斷分析而言，格外重要。
在器官移植中，醫生通常會檢測兄弟姐妹的HLA，以便了解主要組織相容性是否匹配。利用PCR產物的熔解曲線，能快速配對HLA序列。與熔解溫度(Tm)不同，那只是熔解曲線上的一個點，高分辨率熔解是分析整個熔解曲線。利用熔解曲線的形狀作為指示劑，來顯示雜合DNA所形成的異源雙鏈的序列匹配。之后將兩個DNA按1：1的比例混合，重新熔解，并將新曲線與原先的曲線進行比較，來驗證序列的匹配。如果兩個樣品的序列不是完全相同的，那么混合后異源雙鏈的熔解曲線形狀會改變。
瑞典烏普薩拉大學的OlofGidlöf等曾開發出線粒體基因組中兩個超變區HVI和HVII的HRM分析，以分辨不同個體的DNA，作為法醫鑒定中測序前的預篩選2。研究結果表明，線粒體DNA中HVI和HVII所存在的序列變異確實產生了熔解曲線形狀的差異，能辨別不同個體的DNA，這樣就能排除不匹配的法醫材料，從而節省線粒體DNA測序的時間和費用。另外，與其它技術相比，HRM操作簡單，價格低，能同時篩選大量的樣本。
突變掃描
單堿基改變、插入、缺失都能通過HRM來檢測。在靈敏度和特異性方面，高分辨率熔解也高于dHPLC在內的傳統方法。當變異體為低等位基因片段時，它甚至比DNA測序還靈敏。測序只能檢測低至20%的變異體，而HRM能檢測的變異體低至2%。而且，測序所花的時間、費用和精力，與HRM是不可同日而語的。
對于400bp以下的PCR產物，掃描單堿基變化的靈敏度和特異性皆為100%。對于400到1000bp的PCR產物，靈敏度為96.1%，特異性為99.4%。PCR產物中變異的位置不影響掃描準確性。盡管HRM是為檢測雜合體(一個等位基因發生突變)而設計的，但它也能檢測純合體(兩個等位基因都有突變)。對于半合子變異體(X連鎖或Y染色體)，最好將未知樣品與已知野生型的樣品混合。
LMNA基因的突變會導致多種失調，現在稱之為核纖層蛋白綜合征。由于待研究的個體頗多，故必須用一種特別靈敏且特異的方法來進行突變掃描。于是，GillesMillat等就開發出適合LMNA突變掃描的HRM分析3。他們同時用了HRM和dHPLC兩種方法，對64位患有擴張性心肌病的病人進行篩選。結果表明，凡是dHPLC或直接測序能檢測出的基因變異，HRM分析也能輕松鑒定，且速度比dHPLC快2倍，還更為經濟。研究人員認為，HRM分析是鑒定LMNA遺傳變異的高靈敏、高通量的廉價方法。
基因分型
傳統的基因分型方法不僅耗時費力，還需要購買價格不菲的探針。相比之下，HRM分析則是優勢多多，無需擴增和制備，排除了污染的風險;探針的錢也省了;還能檢測未知的變異體，這一點探針可無能為力。有了飽和染料，PCR產物全程被標記，因此所有的熔解區域都能檢測到。對于同一擴增子內的不同雜合體，通過曲線形狀的差異也能區分開。HRM大約能分辨93%的雜合體。大部分純合體也能通過熔解來分辨，但不是全部。大約有4%的人單堿基變異體有著相同的Tm，且圖像對稱。在這種情況下，可以將已知的純合體與未知的純合體混合，再進行分析。
LasseKristensen等曾為參與甲基代謝的關鍵基因(MTHFR、MTR和DNMT3b)開發出HRM分析，對它們進行基因分型，并在Rotor-gene6000等儀器上進行檢測4。他們認為，與基于TaqMan探針的基因分型相比，HRM分析更經濟。無需使用探針，分析所需的優化也更少，成功率更高。與焦磷酸測序、SNP芯片等多種技術相比，HRM是最佳選擇。
甲基化分析
HRM分析還為DNA甲基化狀態的檢測另辟蹊徑。DNA樣品通過亞硫酸氫鹽的處理，將未甲基化的胞嘧啶轉化成尿嘧啶。這樣，原先未甲基化模板所產生的PCR產物比甲基化模板的Tm要低。HRM還能確定特定樣品中甲基化的比例。將不同比例的甲基化和未甲基化DNA混合，制作出標準曲線，將樣品的熔解曲線與之相比較，從而確定樣品中甲基化的比例。
異常的甲基化模式往往與癌癥相關聯，于是ErciSmith等開發并驗證了快速定量DNA甲基化狀態的HRM分析5。他們利用數學方法來標準化加熱DNA所產生的原始熒光數據，從這些數據中計算出熔解開始和結束的溫度，從而反映模板分子的甲基化水平。之后，他們還用已知甲基化水平的寡核苷酸及DNA進行了驗證。他們發現，通過HRM分析這種快速單管的方法來定量甲基化是可靠的，引物容易設計，且無需專門的軟件。所獲得的參數提供了標本中甲基化的客觀描述和定量，能用于標本之間的統計學比較。
綜上，HRM技術應用廣泛，操作簡單又經濟，結果精確且可靠，適合任何實驗室使用。市場上有一些專供HRM分析的儀器，不過，那些帶有HRM功能的定量PCR儀則更實用。QIAGEN的Rotor-GeneQ(CorbettRotor-Gene6000)就是全球第一臺將實時擴增與HRM分析技術相結合的實時熒光定量分析裝置。Rotor-GeneQ的溫度均一性為0.01°C，溫度分辨率為0.02°C，解決了溫度均一性、精確性和分辨率的問題，實現了定量擴增與HRM的合二為一。
